Au-delà des études d'association à l'échelle du génome : Étude transcriptomique et identification des variants régulateurs impliqués dans le développement du sepsis - Aix-Marseille Université
Theses Year : 2019

Beyond genome-wide association studies: Transcriptomic study and identification of regulatory variants involved in the development of sepsis

Au-delà des études d'association à l'échelle du génome : Étude transcriptomique et identification des variants régulateurs impliqués dans le développement du sepsis

Abstract

In 2017, the World Health Assembly and the World Health Organization made sepsis a global health priority by adopting a resolution to improve, prevent, diagnose and manage sepsis. This disease kills a person in the world every 3.5 seconds, mainly people who are already weak, such as newborns or the elderly, but also patients who have undergone medical interventions. It has been shown that the patient's condition and the host's immune response are essential in the development of the disease. A better understanding of the molecular and cellular basis of the disease is needed. Although often questioned, the use of the mouse model makes it possible to mimic the pathophysiology of human sepsis. My thesis project consisted in studying the transcriptional response of peritoneal cells. For this purpose, sterile inflammation was caused by injection of LPS, derived from Pseudomonas aeruginosa, into the peritoneum of the mouse. The peritoneal cell response of these mice was studied during the inflammatory peak and just before death, and these results were compared with molecular data from patients with sepsis. The results allowed us to show that the mouse model partly reflects the observations made in patients. This makes it possible to consider studies in this model to document cause-and-effect relationships and in particular to test the role of certain genes in physiopathology. In addition, I looked for polymorphisms that could both alter the level of gene expression and change the survival of patients with sepsis. Since the advent of genome-wide association studies, a significant number of polymorphisms (SNPs) have been identified as being associated with a phenotype or pathology. Each of these SNPs is a "SNP tag" because hundreds of variants in genetic linkage disequilibrium are inherited at the same time. To establish the causality of a genetic variant associated with the disease, its effect must be clearly demonstrated at the molecular level and a link to the disease must be demonstrated. Using a GWAS approach, we identified 139 SNPs associated with early (before 7 days) or late (between 7 and 28 days) mortality in a cohort of 832 sepsis patients in the laboratory. I have identified 1450 SNPs with a strong linkage imbalance with associated SNPs, of which 1439 are located in non-coding regions close to genes. In order to identify causal SNPs that may have a regulatory role and to understand the molecular mechanisms underlying the association of these polymorphisms, I have characterized the cis-regulatory effects of these SNPs through bioinformatics and experimental functional approaches. I have identified those that are located in regulatory regions such as enhancers, silencers or promoters and could thus modulate gene expression. I prioritized the SNPs and selected the best candidate SNP for experimental validation. I used the Crispr-Cas9 technique and the reporter assay technique to test the function of the region containing the SNP on the one hand and the effect of the SNP itself on the other. The results show that the region containing rs143356980 has enhancer activity on the CISH gene in cells stimulated or not by gamma-IFN or LPS. They also show that rs143356980 modifies this activity in cells stimulated or not by gammaIFN. These 2 projects highlight regulatory mechanisms of key genes potentially involved in the survival of patients with sepsis.
En 2017, l'Assemblée mondiale de la Santé et l'Organisation mondiale de la Santé ont fait du sepsis une priorité de santé mondiale en adoptant une résolution pour améliorer, prévenir, diagnostiquer et gérer le sepsis. Cette pathologie tue une personne dans le monde toutes les 3,5 secondes principalement des personnes déjà fragilisées comme les nouveau-nés ou les personnes âgées mais aussi les patients ayant subis des interventions médicales. Il a été démontré que l'état du patient et la réponse immunitaire de l'hôte est primordiale dans le développement de la pathologie. Une meilleure compréhension des bases moléculaires et cellulaires de la maladie est nécessaire. Bien que souvent remis en cause, l'utilisation du modèle murin permet de mimer la physiopathologie du sepsis humain. Mon projet de thèse a consisté à étudier la réponse transcriptionnelle des cellules péritonéales. Pour cela une inflammation stérile a été provoquée par injection de LPS, issus de Pseudomonas aeruginosa, dans le péritoine de la souris. La réponse des cellules péritonéales de ces souris a été étudiée au cours du pic inflammatoire et juste avant la mort, puis ces résultats ont été comparés aux données moléculaires issues de patients atteints du sepsis. Les résultats nous ont permis de montrer que le modèle souris reflète en partie les observations faites chez les patients. Ceci permet d‘envisager des études dans ce modèle pour documenter des relations de cause à effet et de tester notamment le rôle de certains gènes dans la physiopathologie. De plus, j‘ai recherché des polymorphismes qui pourraient à la fois altérer le niveau d‘expression de gènes et modifier la survie de patients atteints de sepsis. Depuis l'avènement des études d'association à l'échelle du génome, un nombre important de polymorphismes (SNP) ont été identifiés comme étant associés à un phénotype ou à une pathologie. Chacun de ces SNPs est un "tag SNP" car des centaines de variants en déséquilibre de liaison génétique sont hérités en même temps. Pour établir la causalité d'un variant génétique associé à la maladie, il faut démontrer clairement son effet à l‘échelle moléculaire et prouver un lien avec la maladie. Par une approche GWAS, nous avons identifié au laboratoire 139 SNPs associés à la mortalité précoce (avant 7 jours) ou tardive (entre 7 et 28 jours) dans une cohorte de 832 patients atteints de sepsis. J‘ai identifié 1450 SNPs en fort déséquilibre de liaison avec les SNPs associés, dont 1439 se situent dans des régions non codantes proches de gènes. Dans le but d‘identifier les SNPs causaux pouvant avoir un rôle régulateur et de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l‘association de ces polymorphismes, j'ai caractérisé les effets cis-régulateurs de ces SNPs par des approches bio-informatiques et des approches fonctionnelles expérimentales. J‘ai identifié ceux qui se situent dans des régions régulatrices comme les enhancers, les silencers ou les promoteurs et qui pourraient ainsi moduler l‘expression des gènes. J‘ai ainsi priorisé les SNPs et sélectionné le meilleur SNP candidat pour une validation expérimentale. J‘ai utilisé la technique de Crispr-Cas9 et la technique du gène rapporteur pour tester d‘une part la fonction de la région contenant le SNP et d‘autre part l‘effet du SNP lui-même. Les résultats montrent que la région contenant rs143356980 a une activité enhancer sur le gène CISH dans des cellules stimulées ou non par le IFN-gamma ou le LPS. Ils montrent aussi que rs143356980 modifie cette activité dans des cellules stimulées ou non par le IFN-gamma. Ces 2 projets mettent en évidence des mécanismes de régulation de gènes clés potentiellement impliqués dans la survie des patients atteints de sepsis.
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Florian Rosier. Au-delà des études d'association à l'échelle du génome : Étude transcriptomique et identification des variants régulateurs impliqués dans le développement du sepsis. Bio-Informatique, Biologie Systémique [q-bio.QM]. Aix-Marseille Université, 2019. Français. ⟨NNT : 2019AIXM0542⟩. ⟨tel-04426162⟩

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