Décryptage de dynamiques épigénomiques au cours de la thymopoïèse et de la spermatogénèse en appliquant une méthodologie de recherche reproductible à des données de séquençage à haut débit - Aix-Marseille Université Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2019

Deciphering epigenomic dynamics during thymopoiesis and spermatogenesis by applying a reproducible research methodology to high-throughput sequencing data

Décryptage de dynamiques épigénomiques au cours de la thymopoïèse et de la spermatogénèse en appliquant une méthodologie de recherche reproductible à des données de séquençage à haut débit

Résumé

The development over the last decade of numerous experimental methods based on high throughput sequencing technologies has broadened the possibilities for exploring the functioning of the genome of organisms. The level of expression of all genes, accessibility and local modifications of chromatin, as well as protein binding sites on DNA are information accessible by widely democratized approaches. The data produced by these approaches are characterized by their large size, complexity and reusability for scientific applications beyond the one they were initially generated. These characteristics have favored the creation of successful international projects for the generation and sharing of these data to the scientific community. The computer treatments that can be applied to them are of a great diversity in terms of principles, tools, algorithms, parameters and statistic tests. Different choices can sometimes lead to divergent results debated by scientists. It is then essential to have a methodology for the processing of these data which allows to ensure a complete reproducibility of the results while granting flexibility of development allowing the application of different treatments in parallel. An implementation of such a methodology is presented in this thesis, complemented by three useful tools for the treatment of certain types of data from sequencing. This implementation was realized thanks to, but also for projects of studies of epigenetic mechanisms, mainly centered around the human thymopoiesis and the murine spermatogenesis. However, the principles to be followed in the methodology are designed to be as general as possible and can be applied to produce all types of analysis based on a sequence of command line tools. ChIP-Seq, ATAC-Seq, WGBS and RNA-Seq data analyzes from the first project allowed the epigenetic landscapes of the thymic subpopulations to be consistently and orderly compared with those of all populations from hematopoietic lineages. Secondly, these analyzes have shown that a majority of the distal regulatory elements are constitutively demethylated during the differentiation of T lymphocytes, regardless of their activation state. One of them, the TCRA gene enhancer, Ea, is in an open and demethylated state as early as the earliest stages of thymopoiesis while it only activates late. Transcriptomic data revealed that the expression level of transcription factors HOXA5-9 decreases as Ea activates. Finally, these analyzes guided the discovery by other biological approaches of the role of HOXA9 in blocking the TCRA rearrangement mechanism. Regarding the study of murine spermatogenesis, the analysis of ChIP-Seq data at different stages of differentiation made it possible to characterize the acetylation and butyrylation of lysines 5 and 8 of histone 4 as four strongly correlated post-translational modifications marking the highly transcribed genes. MNase-Seq data analysis has shed light on the dynamics of eviction, replacement and repositioning of nucleosomes during spermiogenesis. Other MNase-Seq analyzes have characterized the impact of the incorporation of a histone variant, H2AL2, and the expression of a spermiogenesis-specific transcription factor, Nut, on the structure of chromatin.
Cette dernière décennie, le développement de nombreuses méthodes expérimentales basées sur les technologies de séquençage à haut débit ont élargi les possibilités d’exploration du fonctionnement du génome des organismes. Le niveau d’expression de l’ensemble des gènes, l’accessibilité et les modifications locales de la chromatine, ainsi que les sites de fixations de protéines sur l’ADN sont des informations accessibles par des approches largement démocratisées. Les données produites par ces approches sont caractérisées par leur taille importante, leur complexité et leur réemployabilité pour des applications scientifiques au delà de celle pour laquelle elles ont été initialement générées. Ces caractéristiques ont favorisé la création de projets internationaux fructueux pour la génération et le partage de ces données à la communauté scientifique. Les traitements informatiques qu’il est possible de leur appliquer sont d’une grande diversité en termes de principes, outils, algorithmes, paramètres et tests statististiques. Des choix différents peuvent parfois mener à des résultats divergents débattus par des scientifiques. Il est alors primordial de disposer d’une méthodologie pour le traitement de ces données qui permette d’assurer une reproductibilité complète des résultats tout en accordant une flexibilité de développement permettant l’application de différents traitements en parallèle. Une implémentation d’une telle méthodologie est présentée dans cette thèse, complé- mentée de trois outils utiles pour le traitement de certains types de données issues du sé- quençage. Cette implémentation a été réalisée grâce à, mais aussi pour des projets d’études de mécanismes épigénétiques, principalement centrés autour de la thymopoïèse humaine et de la spermatogénèse murine. Pour autant, les principes à suivre dans la méthodologie sont pensés pour être les plus généraux possibles et peuvent être appliqués pour produire tous types d’analyses basées sur un enchaînement d’outils en ligne de commande. Les analyses de données ChIP-Seq, ATAC-Seq, WGBS et RNA-Seq du premier projet ont permis premièrement de replacer de manière cohérente et ordonnée les paysages épigéné- tiques des sous-populations thymiques par rapport à ceux de toutes les populations issues de lignées hématopoïétiques. Deuxièmement, ces analyses ont montré qu’une majorité des éléments régulateurs distaux sont déméthylées de manière constitutive au cours de la différentiation des lymphocytes T, et ce indépendamment de leur état d’activation. L’un d’eux, l’amplificateur du gène du TCRA, Ea, est dans un état ouvert et déméthylé dès les étapes les plus précoces de la thymopoïèse alors qu’il ne s’active que tardivement. Les données transcriptomiques ont révélé que le niveau d’expression des facteurs de transcription HOXA5-9 diminuent au moment où Ea s’active. Finalement, ces analyses ont permis de guider la découverte par d’autres approches biologiques du rôle d’HOXA9 dans le blocage du mécanisme de réarrangements du TCRA. Concernant l’étude de la spermatogénèse murine, l’analyse de données ChIP-Seq à différents stades de différentation a permis de caractériser l’acétylation et la butyrylation des lysines 5 et 8 de l’histone 4 comme étant quatre modifications post-traductionnelles fortement corrélées et marquant les gènes hautement transcrits. L’analyse de données MNase-Seq a permis de lever le voile sur la dynamique d’éviction, de remplacement par des protamines, et de repositionnement des nucléosomes au cours de la spermiogénèse. D’autres analyses MNase-Seq ont permis de caractériser l’impact de l’incorporation d’un variant d’histone, H2AL2, et de l’expression d’un facteur de transcription spécifique de la spermiogénèse, Nut, sur la structure de la chromatine.
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Citer

Guillaume Charbonnier. Décryptage de dynamiques épigénomiques au cours de la thymopoïèse et de la spermatogénèse en appliquant une méthodologie de recherche reproductible à des données de séquençage à haut débit. Bio-Informatique, Biologie Systémique [q-bio.QM]. Aix-Marseille Université, 2019. Français. ⟨NNT : 2019AIXM0285⟩. ⟨tel-04426858⟩

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