High-throughput study of silencer elements in T cells - Aix-Marseille Université Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2019

High-throughput study of silencer elements in T cells

Etude à haut débit des éléments silencieux dans les lymphocytes T

Résumé

The control of gene expression is fundamental to mammalian cell life. Although much of this control occurs at transcriptional and post transcriptional level. Gene expression is controlled by cis regulatory elements along with numbers of transcription factors combinatorial in mammals. The transcription can only be initiated by the assembly of RNAPII machinery around transcription start site of a gene which is also known as core promoter. Other cis regulatory elements like enhancers, silencers and insulators along with several transcription factors are also involved in gene regulation. There has been increasing number of studies relating enhancer and promoters but silencer has not been studied as much. Previous findings have suggested that some gene is regulated by silencers in T cell differentiation. The stagnation of silencer studies raises several questions whether silencers represent a major genomic strategy of gene regulation. There is lack of high throughput screening technique to identify silencers. My project has carried out aiming to answer these above questions. Firstly, I have repurposed the CapSTARR seq technique to identify activity silencer elements; previously this technique has developed in the lab, which used as an approach to exploiting a high-throughput enhancer activity. Performing CapStarr-seq in mouse p5424 cell line, I found a substantial proportion of regions displaying silencer activity. They display silencer activity in dual luciferase assay. The REST motif found to be enriched in several silencer elements. Moreover, by using comprehensive CRISPR/Cas9 genomic deletion approach, I demonstrated that silencer is generally involved in the regulation of nearby genes. Taken together, our results identify a new high throughput reporter assay to identify silencer element. My thesis is structured into 7 chapters. In chapter 1, I summarize the current understanding about gene regulation in mammals and the important factors contributing to transcriptional regulation. In chapter 2, I focus particularly on the regulatory role of silencer elements on gene expression. Here, the classical view of silencer and the classical reporter assays to identify silencer elements are discussed. There is an overview about silencer found in the hematopoietic system specifically during T cell differentiation. In chapter 3, I discussed respectively about the High throughput techniques that can be used to study regulatory elements. Chapter 4 is focused on the T cell differentiation. The results are organized in chapter 5. This chapter tells about how we identify silencer elements using CapSTARR-Seq technique, and functional validation of silencer elements. In Chapter 6, I give general discussion about results. Finally, in chapter 7, perspectives are mentioned. My work continues to identify silencer elements in different cell lines.
Le contrôle de l'expression des gènes est fondamental pour la vie des cellules des mammifères. La majeur partie de ce contrôle se produisant au niveau de la transcription puis la transcription. Chez les mammifères, l'expression des gènes est contrôlée par des éléments cis-régulateurs ainsi que des combinaisons de facteur de transcription. La transcription ne peut être initiée que par l’assemblage de la machinerie RNAPII autour du site d’initiation de la transcription du gène également appelé région promotrice. D'autres éléments cisrégulateurs tels que les enhancers, les silencers et les insulateurs associés à plusieurs facteurs de transcription sont également impliqués dans la régulation des gènes. Alors que les enhancers et les promoteurs sont largement étudiés par la communauté scientifique, les mécanismes d’actions des silencers restent à l’heure actuelle méconnue. Des recherches antérieures ont suggéré que certains gènes sont réprimés par des silencers dans la différenciation des lymphocytes T. Le manque de connaissance sur les silencers soulève plusieurs questions sur le importance au sein de la régulation génomique. À l’heure actuelle, peu de techniques permettent l’identification et l’étude des éléments silencers. Mon projet a été réalisé dans le but de répondre à ces questions. Premièrement, j'ai réutilisé la technique du CapSTARR-seq afin d’identifier des éléments silencers; Cette technique avait été mise au point dans le laboratoire. Cette technique était utilisée pour l’étude des éléments enhancers. En réalisant le CapStarr-seq dans la lignée cellulaire p5424 de souris, j'ai pu identifier une proportion non négligeable de régions montrant une activité répressive. Des résultats similaires ont été démontrés via un reporter de luciférase. Le motif REST s’est révélé enrichi de plusieurs régions silencers. De plus, en utilisant l’approche de la suppression génomique CRISPR / Cas9, j’ai démontré que les silencers sont généralement impliqués dans la régulation des gènes proches. L’ensemble de nos résultats nous ont permis d’identifier une nouvelle technique de séquence à haut débit pour l’identification d’éléments silencers. Ma thèse est structurée en 7 chapitres. Au chapitre 1, je résume les connaissances actuelles sur la régulation des gènes chez les mammifères et les facteurs importants contribuant à la régulation de la transcription. Dans le chapitre 2, je me concentre particulièrement sur le rôle régulateur des éléments silencers dans l’expression des gènes. Dans ce chapitre, nous discutions du mode d’action « classique » des silencers ainsi que les techniques existant afin de les étudier. On y trouve également un résumé sur les silencers trouvés dans le système hématopoïétique, lors de la différenciation des cellules T. Au chapitre 3, j'aborde les différentes techniques de séquençage à haut débit pouvant être utilisées pour étudier les éléments de régulation génomique. Le chapitre 4 est consacré à la différenciation des cellules T. Les résultats sont présentés au chapitre 5. Ce chapitre explique comment nous identifions les régions silencers avec la technique du CapSTARR-Seq et sur la validation fonctionnelle des silencers. Au chapitre 6, discute d’une façon globale les différents résultats obtenus. Les perspectives sont exposées dans le chapitre 7. Mon travail d’identifications des régions silencers dans différentes lignées cellulaires continue.
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Citer

Saadat Hussain. High-throughput study of silencer elements in T cells. Life Sciences [q-bio]. Aix-Marseille Université, 2019. English. ⟨NNT : 2019AIXM0215⟩. ⟨tel-04426960⟩

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