High-throughput study of silencer elements in T cells
Etude à haut débit des éléments silencieux dans les lymphocytes T
Résumé
The control of gene expression is fundamental to mammalian cell life. Although much of this
control occurs at transcriptional and post transcriptional level. Gene expression is controlled
by cis regulatory elements along with numbers of transcription factors combinatorial in
mammals. The transcription can only be initiated by the assembly of RNAPII machinery
around transcription start site of a gene which is also known as core promoter. Other cis
regulatory elements like enhancers, silencers and insulators along with several transcription
factors are also involved in gene regulation.
There has been increasing number of studies relating enhancer and promoters but silencer has
not been studied as much. Previous findings have suggested that some gene is regulated by
silencers in T cell differentiation. The stagnation of silencer studies raises several questions
whether silencers represent a major genomic strategy of gene regulation. There is lack of high
throughput screening technique to identify silencers.
My project has carried out aiming to answer these above questions. Firstly, I have repurposed
the CapSTARR seq technique to identify activity silencer elements; previously this technique
has developed in the lab, which used as an approach to exploiting a high-throughput enhancer
activity. Performing CapStarr-seq in mouse p5424 cell line, I found a substantial proportion
of regions displaying silencer activity. They display silencer activity in dual luciferase assay.
The REST motif found to be enriched in several silencer elements. Moreover, by using
comprehensive CRISPR/Cas9 genomic deletion approach, I demonstrated that silencer is
generally involved in the regulation of nearby genes. Taken together, our results identify a
new high throughput reporter assay to identify silencer element.
My thesis is structured into 7 chapters. In chapter 1, I summarize the current understanding
about gene regulation in mammals and the important factors contributing to transcriptional
regulation. In chapter 2, I focus particularly on the regulatory role of silencer elements on
gene expression. Here, the classical view of silencer and the classical reporter assays to
identify silencer elements are discussed. There is an overview about silencer found in the
hematopoietic system specifically during T cell differentiation. In chapter 3, I discussed
respectively about the High throughput techniques that can be used to study regulatory
elements. Chapter 4 is focused on the T cell differentiation. The results are organized in
chapter 5. This chapter tells about how we identify silencer elements using CapSTARR-Seq
technique, and functional validation of silencer elements. In Chapter 6, I give general
discussion about results. Finally, in chapter 7, perspectives are mentioned. My work continues
to identify silencer elements in different cell lines.
Le contrôle de l'expression des gènes est fondamental pour la vie des cellules des
mammifères. La majeur partie de ce contrôle se produisant au niveau de la transcription puis
la transcription. Chez les mammifères, l'expression des gènes est contrôlée par des éléments
cis-régulateurs ainsi que des combinaisons de facteur de transcription. La transcription ne
peut être initiée que par l’assemblage de la machinerie RNAPII autour du site d’initiation de
la transcription du gène également appelé région promotrice. D'autres éléments cisrégulateurs tels que les enhancers, les silencers et les insulateurs associés à plusieurs facteurs
de transcription sont également impliqués dans la régulation des gènes.
Alors que les enhancers et les promoteurs sont largement étudiés par la communauté
scientifique, les mécanismes d’actions des silencers restent à l’heure actuelle méconnue. Des
recherches antérieures ont suggéré que certains gènes sont réprimés par des silencers dans la
différenciation des lymphocytes T. Le manque de connaissance sur les silencers soulève
plusieurs questions sur le importance au sein de la régulation génomique. À l’heure actuelle,
peu de techniques permettent l’identification et l’étude des éléments silencers.
Mon projet a été réalisé dans le but de répondre à ces questions. Premièrement, j'ai réutilisé la
technique du CapSTARR-seq afin d’identifier des éléments silencers; Cette technique avait
été mise au point dans le laboratoire. Cette technique était utilisée pour l’étude des éléments
enhancers. En réalisant le CapStarr-seq dans la lignée cellulaire p5424 de souris, j'ai pu
identifier une proportion non négligeable de régions montrant une activité répressive. Des
résultats similaires ont été démontrés via un reporter de luciférase. Le motif REST s’est révélé
enrichi de plusieurs régions silencers. De plus, en utilisant l’approche de la suppression
génomique CRISPR / Cas9, j’ai démontré que les silencers sont généralement impliqués dans
la régulation des gènes proches. L’ensemble de nos résultats nous ont permis d’identifier une
nouvelle technique de séquence à haut débit pour l’identification d’éléments silencers.
Ma thèse est structurée en 7 chapitres. Au chapitre 1, je résume les connaissances actuelles sur
la régulation des gènes chez les mammifères et les facteurs importants contribuant à la
régulation de la transcription. Dans le chapitre 2, je me concentre particulièrement sur le rôle
régulateur des éléments silencers dans l’expression des gènes. Dans ce chapitre, nous
discutions du mode d’action « classique » des silencers ainsi que les techniques existant afin
de les étudier. On y trouve également un résumé sur les silencers trouvés dans le système
hématopoïétique, lors de la différenciation des cellules T. Au chapitre 3, j'aborde les
différentes techniques de séquençage à haut débit pouvant être utilisées pour étudier les
éléments de régulation génomique. Le chapitre 4 est consacré à la différenciation des cellules
T. Les résultats sont présentés au chapitre 5. Ce chapitre explique comment nous identifions
les régions silencers avec la technique du CapSTARR-Seq et sur la validation fonctionnelle
des silencers. Au chapitre 6, discute d’une façon globale les différents résultats obtenus. Les
perspectives sont exposées dans le chapitre 7. Mon travail d’identifications des régions
silencers dans différentes lignées cellulaires continue.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)