Functional defects and molecular mechanisms of Left Ventricular NonCompaction (LVNC) in Nkx2.5 mutant mice - Aix-Marseille Université Access content directly
Theses Year : 2016

Functional defects and molecular mechanisms of Left Ventricular NonCompaction (LVNC) in Nkx2.5 mutant mice

Défauts fonctionnels et mécanismes moléculaires associés à la Non Compaction du Ventricule Gauche (LVNC) chez des souris mutantes pour Nkx2.5

Abstract

The heart is the first organ that forms and functions in the developing vertebrate embryo. It functions as a pump leading to blood circulation throughout the whole body. The cardiac conduction system is a group of specialized cardiomyocytes that initiate and propagate electrical impulses in order to coordinate heart contractions. The transcription factor Nkx2.5 is present early in the embryonic heart (at around E7.5) and is still expressed throughout the developing and adult heart. It also plays a role in maintaining the normal function of the cardiac conduction system. Conditional deletions of Nkx2.5 gene cause disturbance in heart development and cardiomyopathy in the mouse. Furthermore Nkx2.5 mutations have been found in patients with left ventricular non-compaction (LVNC). LVNC is a rare cardiomyopathy, characterized by hypertrabeculation and deep trabecular recesses in the left ventricle. This genetic disorder, associated with several mutations, exhibits clinical, morphological and functional heterogeneity. The main complications are heart failure, systemic embolic events and malignant arrhythmias. It is still unclear whether LVNC results from a defect occurring during cardiac development. One hypothesis to consider is that the severity of LVNC depends on which embryonic stage the arrest of myocardial compaction occurs. Our aim was to study the pathological evolution of LVNC by characterizing functional defects and identifying molecular mechanisms in mouse models with abnormal ventricular trabeculae development. To establish a LVNC mouse model, we generated specific Nkx2.5 conditional knockout by applying the Flox/loxP system inducible by tamoxifen injection to activate Cre recombination. This leads to the deletion of Nkx2.5 allele in atria and trabecular derived cardiomyocytes at embryonic stages when trabeculae arise (at around E10), or start to compact (at around E14), or at neonatal stages (after birth) when the heart is almost finish compaction step. To quantify the degree of non–compaction and the subendocardial and interstitial fibrosis, we carried out immunofluorescence analyses on left ventricular sections. Functional analyses show defects in ECG recordings with increased PR and QRS durations. This phenotype worsens with age with bundle branch blocks and a diminution in the ejection fraction at 6 months following deletion at E10.5/11.5 but not E13.5/14.5, consistent with a more pronounced phenotype after deletion at the earlier developmental stage. Microarray comparison of the transcriptomes of 6 month-old mice with different LVNC levels induced by Nkx2.5 deletion at the two timepoints, revealed differences in ventricular gene expression between the two groups, predominantly in pathways involved in calcium signaling, blood vessel development and immune or inflammatory processes. Deregulated expression of numerous genes playing a crucial role in cardiac cell activity or cardiomyocyte differentiation correlates with the different phenotypes observed in these mutant mice. To sum up, we were successful in generating several LVNC mouse models by the conditional deletion of Nkx2.5 transcription factor in atria and trabecular derived cardiomyocytes. These mouse models are suitable for studying LVNC pathology. We also confirmed the hypothesis that the severity of LVNC depends on stages when disturbances in the trabecular development occur. Hypertrabeculation, cardiac conduction defects, decreased ejection fraction, and existence of fibrosis are robustly observed following deletion at E10.5/11.5 meaning that the deletion at early stage of trabecular development causes the most severe pathological phenotype of LVNC. There had been just a few publications showing inflammation in LVNC heart, which could be a very good finding for future researches.
Le cœur est le premier organe à se former et à fonctionner lors du développement embryonnaire. Il s'agit d'une pompe qui permet au sang de circuler dans tout l'organisme. Le système de conduction cardiaque est constitué d'un groupe de cardiomyocytes spécialisés qui initie et propage les impulsions électriques afin de coordonner les contractions cardiaques. Le facteur de transcription Nkx2.5 est présent dans le cœur dès E7.5 et reste exprimé durant tout le développement et dans le cœur adulte. Il joue également un rôle dans le maintien de la fonction du système de conduction cardiaque. Des délétions conditionnelles du gène Nkx2.5 induisent des perturbations durant le développement du cœur et des cardiomyopathies chez la souris. De plus, des mutations de Nkx2.5 ont été trouvées chez des patients atteints de LVNC (left ventricular non-compaction). La LVNC est une cardiomyopathie rare, caractérisée par une hypertrabéculation et de profonds replis du ventricule gauche. Cette maladie génétique, associée à de nombreuses mutations, présente une hétérogénéité fonctionnelle, morphologique et clinique. Les principales complications sont la défaillance cardiaque, l'embolie systémique et des arythmies sévères. A ce jour, nous ne savons toujours pas si la LVNC résulte d'un défaut se produisant durant le développement cardiaque et si sa gravité dépend du stade embryonnaire auquel l'arrêt de la compaction se produit. Notre objectif a été d'étudier l'évolution pathologique de la LVNC en caractérisant les défauts fonctionnels et en identifiant les mécanismes moléculaires dans des modèles de souris présentant un développement anormal des trabécules ventriculaires. Pour établir un modèle de LVNC, nous avons généré des souris KO conditionnel pour Nkx2.5 grâce au système Flox/loxP inductible par injection de tamoxifène qui active la recombinaison Cre. Nous avons ainsi supprimé l'allèle Nkx2.5 dans l'oreillette et les cardiomyocytes dérivant des trabécules. Nous avons choisi de sipprimé Nkx2.5 au stade embryonnaire E10 quand le trabécule s'accroît, au stade E14 quand il se compacte, ou juste après la naissance quand le cœur a terminé son processus de compaction. Afin de quantifier le degré de non-compaction et la fibrose interstitielle et subendocardique, nous avons analysé des sections ventriculaires gauches par immunofluorescence. Au niveau fonctionnel, les ECG montrent une augmentation des intervalles PR et QRS qui conduisent avec l'âge à des blocs de branches, accompagnés à 6 mois d'une diminution de la fraction d'éjection observable uniquement après la délétion à E10. En comparant les transcriptomes réalisés sur des souris âgées de 6 mois dans lesquelles la délétion de Nkx2.5 a été réalisée à E10 et à E13, nous avons révélé des différences importantes de l'expression des gènes ventriculaires, particulièrement dans les voies impliquées dans la signalisation calcique, le développement des vaisseaux sanguins, et les processus immunitaires et inflammatoires. L'expression modifiée de gènes jouant un rôle crucial dans l'activité des cellules cardiaques ou la différenciation des cardiomyocytes est parfaitement corrélée avec les différents phénotypes observés dans ces souris mutantes. En résumé, nous avons réussi à générer différents modèles de LVNC, dans lesquelles nous avons pu étudier cette pathologie, en supprimant le facteur de transcription Nkx2.5 dans les oreillettes et les cardiomyocytes dérivés des trabécules. Nous avons également confirmé que la sévérité de la LVNC dépend du stade de développement du trabécule auquel le défaut se produit. Peu de publications décrivent à ce jour les mécanismes responsables de l'état inflammatoire observé dans la LVNC, nos résultats sont donc prometteurs pour de futures recherches dans cette voie.
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Thi Hong Minh Nguyen. Functional defects and molecular mechanisms of Left Ventricular NonCompaction (LVNC) in Nkx2.5 mutant mice. Life Sciences [q-bio]. Aix-Marseille Université, 2016. English. ⟨NNT : 2016AIXM4039⟩. ⟨tel-04529606⟩
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